独家专访中国学者《Nature》子刊发布最大规模肺癌T细胞单细胞免疫图谱

关键词：肺癌  单细胞测序   T细胞

阅读时间：约7分钟

文/基因慧

2018年6月26日凌晨1:00，《Nature Medicine》发表迄今针对肿瘤相关T细胞的规模最大的单细胞组学研究，北大张泽民教授团队通过非小细胞肺癌12,346个T细胞的单细胞测序及分析，发现了可能的肺癌新靶点。基因慧对张泽民教授及该研究主要参与者进行了独家深度采访。欢迎留言参与讨论。

图1：  肿瘤免疫细胞单细胞测序流程图，图片来自《Nature Medicine》

1 研究背景

· 免疫治疗癌症的效果判断缺乏依据

· 肿瘤的免疫逃逸机制使T细胞受到抑制

· 北大张泽民团队的癌症单细胞转录组测序技术

当前免疫治疗已经成为治疗多种癌症的有效策略而受到广泛关注。但对治疗效果的判断还相当缺乏依据，比如接收同样药物治疗的同一类癌种的患者，为什么效果相距甚远？这意味着肿瘤免疫过程中的一些基础性问题还有待解答。

T淋巴细胞是消灭癌细胞的核心免疫细胞类型，但是由于肿瘤具有多种免疫逃逸机制，即使是浸润在肿瘤组织内部的T细胞也受到广泛的抑制。面对肿瘤微环境中不同类型的免疫细胞，单细胞水平的基因组测序和生物信息学分析手段大有用武之地。

北京大学张泽民实验室将单细胞转录组测序技术应用于肿瘤研究已经在国际上占有一席之地。2017年6月15日，张泽民团队在《Cell》发文，首次刻画了肝癌T细胞的免疫图谱（基因慧独家专访）。时隔一年，他们在《Nature Medicine》发表题为“Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing”的研究论文，带来了肺癌的研究成果。基因慧独家采访报道内容如下。

2 研究成果

· T细胞亚群免疫特征

· 耗竭前T细胞与耗竭性T细胞浸润比例与预后相关

· 激活态Treg的比例与肺腺癌病人的预后相关

· 新生物标志物

【基因慧】张教授，继去年6月您在《Cell》杂志发表肝癌 T细胞图谱研究（详情），时隔一年， 您带领团队完成了非小细胞肺癌12,346个T细胞的单细胞测序工作， 发表在 《Nature Medicine》上，据说是国际上肿瘤相关T细胞的规模最大的单细胞组学研究，您能通俗地向基因慧读者谈谈这项成果的发现和意义吗？

【张泽民教授】郭心怡博士是本研究核心人物，第一位的共同一作，可以为读者解答这个问题。

【郭心怡博士】该项研究完成了来自14例非小细胞癌初治患者外周血、癌组织及癌旁组织的12,346个T细胞的单细胞测序工作。基于T细胞的转录组数据及T细胞受体（TCR）序列，我们从单细胞层面观察到CD8+ T细胞群体存在大量克隆扩增，进而刻画了T细胞功能亚群、各亚群的组织分布特征及亚群间的状态转换关系等免疫特征，这包括一个耗竭性T细胞亚群和两个耗竭前T细胞亚群，耗竭前T细胞与耗竭性T细胞的浸润比例与肺腺癌患者预后相关。

在CD4+T细胞中发现肿瘤浸润的Treg中存在的异质性，根据 TNFRSF9的表达可以将其分为活性高低的两群，其中激活态Treg的比例与肺腺癌病人的预后相关。这些生物标志物的发现对肺癌病人的临床分型具有重要指导意义，也为肺癌精准治疗提供了新的思路。

图2：张教授团队照片，照片由实验室团队提供

3 技术路线的创新与突破

· 肺癌T细胞有三个亚群

· 辅助T细胞和调节T细胞

【基因慧】此前，《Nature Immunology》报道肺癌浸润 CD8 T 细胞的组织原位记忆特征，是将 CD8 细胞作为一个群体进行了研究，而本次发现肺癌 T细胞有三个亚群，能谈谈其中的方法创新和突破吗?特别是在技术路线上。

【郑良涛】（负责生物信息分析、本研究共同一作）Anusha Preethi Ganesan 等2017年发表在《Nature Immunology》的工作很不错，利用RNAseq、流式细胞术等技术对肺癌的CD8+ T细胞的分子特征作了初步的分析。

与之相比，我们的研究主要是利用单细胞转录组测序技术，得到了质量更好的、单个细胞级别这样高分辨率的数据。相应的，我们的数据也给我们带来了对肺癌T细胞免疫更深入的了解。Anusha Preethi等的工作可以看到TIL作为一个群体，其TCR通路和免疫检验点相关基因的表达在肺癌病人间的异质性，而我们的数据还可以看到同样一个病人的TIL内部不同的单细胞的异质性。

在Anusha Preethi的研究里，作者从RNAseq数据里提取出来TCR beta的序列、计算克隆指数。而我们的研究里在同一个细胞中得到转录组信息的同时，组装出了全长的TCR序列，包括alpha链和beta链；不仅作了TCR克隆扩增分析，还根据每个细胞的TCR序列追踪T细胞的状态转换。完整的转录组信息、TCR信息给我们测试、筛选肿瘤抗原特异的TCR序列提供了独特的机会。

Anusha Preethi的分析认为显示了组织驻留记忆T细胞（TRM）特征的TIL与T细胞毒性反应的强度有关，并且更高密度的TRM预示着肺癌病人更好的生存结果。实际上，Anusha Preethi的数据里，TRM特征是和T细胞耗竭程序偶联在一起的，即高表达了TRM的TIL群体也高表达了PDCD1、4-1BB、HAVCR2等抑制T细胞功能的基因。从我们的数据发现，TIL可以分为三个主要亚群，其中包括一群显示了耗竭状态相关基因的高度表达，同时也显示了TRM特征，我们定义为“耗竭细胞”（Tex）；另一群同样也显示了TRM的特征，但没有显示耗竭的状态，这群细胞有Hobit(ZNF683)的特异高表达（Hobit-hi TRM）。Hobit是另一个TRM的特征基因，而在Anusha Preethi的研究中并未提及。我们的分析显示，Hobit-hi TRM 相对于Tex的比例，可以作为预后的指标，TIL中有更高比例的Hobit-hi TRM 的肺癌患者有更好的生存。耗竭细胞对肿瘤免疫的作用目前还未彻底弄清楚，更精确的区分出TIL的不同功能状态对后续研究有指导意义。因此我们的研究实际上比Anusha Preethi又跨出了一步。

【张园园】（负责生物信息分析、本研究共同一作）我们还刻画了CD4+效应T细胞、CD8+效应T细胞的特征，发现这两群效应T细胞在肺癌患者里有较高的克隆扩增、并且具有较高的细胞迁移通路的活性。从组织分布角度分析，我们发现这两群细胞在外周血、癌旁组织、组织里都有分布。此外，Anusha Preethi的研究只局限于CD8+ TIL，我们的研究同时做了辅助T细胞、调节T细胞的分析，发现Treg中具有预后意义的特征。因此，我们的研究更全面、更细致。

图3：张教授团队和北医三院团队合影，照片由实验室团队提供

4 肝癌与肺癌研究的异同

· 免疫治疗对肺癌有更高的响应率

· 肺癌和肝癌中都存在耗竭T细胞

· PanCancer 研究取得初步结果

【基因慧】您曾于去年 6月在《Cell 》发表大规模肝癌 T细胞图谱研究。肝癌和肺癌，这两种重大癌症免疫反应有什么异同呢？不同癌症的T细胞研究是否可以相互借鉴？接下来您是否有考虑 Pan-Cancer （泛癌症） 的研究或者继续针对下一个癌种？

【张泽民教授】临床上，目前来看免疫治疗对肺癌有更高的响应率，而实际上肝癌也是有较多T细胞浸润的。从我们的肝癌T细胞研究和肺癌T细胞研究中可以看到肝癌患者的T细胞和肺癌患者的T细胞的相似的地方，也可以看到两者不一样的地方。

对于CD8+ TIL，在两个癌种里我们都看到了耗竭T细胞的存在，并且它们显示了非常相似的基因表达特征；两个癌种里也都有一群高表达GZMK的未耗竭T细胞。然而，肝癌里有更多的MAIT细胞，这可能和肝组织的免疫特点有关系；肺组织里有更多的效应T细胞，特别是，肺癌里有明显更多的Hobit-hi TRM。这些特点可能和肺癌更好的免疫治疗效果有关。

我们使用了类似的技术对不同的癌症进行分析，在单细胞技术、数据分析方法等方面可以相互借鉴。我们认为，我们现在分析的癌症以及样本量，还不能覆盖所有的癌症和患者的情况。因此我们还会继续分析其它癌种。我们已经正在用包括SMART-seq2和10X在内的单细胞技术，分析多个癌种的肿瘤微环境，不仅包括T细胞，还包括其他免疫细胞、其他非免疫细胞以及肿瘤细胞；我们也在开展对免疫细胞的表观调控分析。

【郑良涛】我们已经在进行 Pan-Cancer 的研究，也有了一些初步结果，希望不久的将来可以和大家分享。

5 产、学、研、医合作模式

· 学校、医院、药厂协同

· 探索临床需求

· 高质量数据引导生物学发现

【基因慧】我们看到，这项重大研究成果是北大生科院、北京未来基因诊断高精尖创新中心、北大-清华生命科学联合中心、北医三院胸外科以及拜耳制药公司的肿瘤部门共同联合完成，对于这样的产、学、研、医合作模式，您觉得有哪些值得推广的地方。

【张泽民教授】我们实验室做科研的理念是用最尖端的技术、最扎实的科学来攻克肿瘤治疗和制药中最亟待解决的问题。所以我们一方面跟医院合作，探索临床需求，另一方面我们和药物开发团队合作，定位新靶点发现的难点和机会，然后利用我们实验室人员的实验和计算优势，把前沿的单细胞技术有效地应用到肿瘤上，把最新最深入的生物信息方法用于大量的单细胞测序数据上，最终让这些高质量的数据引导我们得到新的生物学发现。

未来的科学是朝着大科学的方向走的，我们现在实验室这样的做法也是为了学生们创造了一个多方位合作的环境，让他们尽早适应这样的大科学需要，对学生也是很好的锻炼。总之，这样的产、学、研、医的几方面合作模式是双赢和多赢的模式，我们将继续按这条路走下去，也希望其他实验室从这方面考虑。

6 药物靶点和新药研发的落地

· Hobit（ZNF683）是CD8 TIL的一个标志

· 新药物靶点

· TCR可能对CAR-T开发有指导意义

【基因慧】PD -L1 药物已经进入中国，相信 CAR -T药物也即将进入。这次研究中发现的“耗竭前”细胞可以作为肺腺癌标志物吗，距离药物靶点和新药研发还有哪些落地路径和多久周期呢？

【张园园】我们的研究发现，耗竭前T细胞，也就是Hobit-hi TRM相对比例高的患者有更好的预后，Hobit（ZNF683）是这群CD8 TIL的比较好的一个标志。我们觉得值得对这群细胞、耗竭T细胞以及它们之间的关系做进一步的研究。

【胡学达博士】（张教授课题组的副研究员，指导湿实验）我们已经根据耗竭T细胞、激活态的调节T细胞的表达特征提出了一些药物靶点，其中一些已经有合作方正在开展下游的实验。我们也在测试和筛选肿瘤抗原特异的TCR，这些TCR有可能对CAR-T的开发有指导意义。

7 单细胞研究的产研医协作

· 实验流程和技术标准化

· 提高单细胞实验结果稳定性

· 整合不同技术平台产生的单细胞测序数据

【基因慧】单细胞研究正在从科研走向产业化。在您科研过程中，对于单个单细胞分离、鉴别、聚类等实验和数据分析，您认为还存在哪些挑战，需要产业方和科研、临床如何协作攻克难关？

【任仙文博士】（张教授课题组的副研究员、指导生物信息分析）单细胞技术现在发展得特别快，也带来很多前所未有的挑战，包括实验技术方面的和数据分析方面的。

实验技术方面，因为是高精尖技术，单个细胞的分离、捕获，RNA / DNA的扩增等步骤往往会存在明显的批次效应。如何通过实验流程和技术的标准化来提高单细胞实验结果的稳定性、减弱批次效应，我想需要产业方和科研、临床多方进行协作来攻克难关。

数据分析方面，目前的单细胞RNA测序数据有比较高的缺失率，不同的单细胞测序技术之间缺失率也相差较大。如何利用计算的方法补全缺少的数据，如何通过标准化来整合不同技术平台产生的单细胞测序数据是当前面临的重要技术难题。随着单细胞测序的广泛应用，单细胞测序的数据量也正在以几何级数的速率在增长，如何快速、准确地分析数据，从中获得生物学家、临床大夫感兴趣的结果，也是产业方、科研、临床三方协作攻关的契合点。

临床是医学研究的起点和终点，科研方主要负责科学问题、研究方案的把握，而产业方可以带来标准和效率，三方合作为解决这些问题提供了有利条件。

8 单细胞技术发展趋势与应用前景

· 未来将实现同一个细胞的多组学测序

· 对细胞空间属性和相互作用测定

· 与荧光标记、显微切割等技术结合

· 肿瘤、生殖、免疫等多领域应用

【基因慧】单细胞是生命科学从高通量走向高精度的又一跨越，作为业内专家，您认为单细胞技术发展趋势和应用前景是怎样的？

【张泽民教授】细胞是生命的基本单元。毫无疑问，单细胞技术将会引领新一波基础和临床医学的技术革命。目前比较成熟的单细胞测序技术主要还是基因组和转录组测序，未来的发展趋势将实现高通量的表观遗传组的单细胞测序，实现同一个细胞的多组学测序，也就是在基因组、转录组、表观遗传组甚至包括蛋白质组等多个层面实现对同一个细胞进行检测。

通过与其他技术比如荧光标记、显微切割等结合，单细胞技术甚至可以实现对一块组织中所有细胞的空间属性和相互作用的测定。目前这些技术都已经出现了非常好的苗头，随着时间推移，它们必然会日趋成熟，在肿瘤、生殖、免疫等等许多生物医学领域中都会得到广泛的应用，解决一批用传统技术不能解决的问题。中国成语“如虎添翼”说得好，传统技术如同是“虎”，单细胞技术则是“翼”，单细胞技术的发展会给许多的传统技术添上“翼”，进而引发生物医学领域的革命。

【感谢张教授团队接受基因慧专访，科研成果第一作者免费专访，欢迎联系我们 [e-mail], 400-088-7466 】

推荐阅读

新媒体编辑

专栏作者

行业分析师

▼ 首个数字生命健康产业大数据平台

（点击图片查看详情）

关于基因慧

GeneClub

基因慧是数字生命健康领域专业的科技媒体和咨询机构。基于深耕十年的专业性，我们致力于建立行业信用评级和决策咨询的大数据平台，为医疗健康等机构提供科普宣传、行研咨询和产业链接服务，赋能产学政的融合，使连接产生价值，用数据决策未来。 

基因慧作为“十三五”重点图书《临床生物样本库的探索与实践》编委单位，广东省精准医学学会遗传病分会常委单位、深圳市健康产业发展促进会副会长单位，在行业大会上发布了《2018年基因行业创投报告》等数个报告（详情），参与组织首个《临床基因检测报告规范与基因检测行业共识》落地（详情），主办了首届数字健康私董会（详情），为政府和产业决策者提供行业咨询和市场调研服务。

▼  点击阅读原文，直达YourMap产业地图